Durante el XI Simposio Biopsia Líquida, celebrado en Santiago de Compostela, Ignacio Cardona, de Diagnóstica Longwood (Madrid), puso de relieve la importancia de la biología espacial como enfoque esencial para entender la complejidad del microambiente tumoral (TME). Según Cardona, “este campo permite responder preguntas fundamentales sobre qué tipos de células están presentes en el tumor, dónde se localizan, cómo se organizan en vecindades celulares y qué relaciones funcionales establecen entre sí”. Asimismo, explicó que “facilita el estudio de la infiltración de células inmunitarias, la interacción entre el tumor y el sistema inmunitario, y la identificación de subtipos celulares y sus funciones clave, con el objetivo final de mejorar el diagnóstico y el diseño de terapias más eficaces”.
En este contexto, presentó la tecnología de estampado para células en suspensión, conocida como STAMP, que permite el análisis transcriptómico unicelular y el perfilado multimodal mediante imágenes, sin necesidad de secuenciación. “Esta aproximación destaca por la notable reducción de costes y por la flexibilidad en el diseño experimental, lo que posibilita el análisis de millones de células o la multiplexación a gran escala de condiciones, perturbaciones y tipos de muestras”, expresó.
La plataforma CosMx™ SMI fue uno de los ejes centrales de la presentación de Cardona. Este sistema permite el uso de paneles de gran tamaño, con más de 6.000 dianas y análisis de transcriptoma completo (WTX), y es compatible con múltiples tipos de muestra, incluidos tejidos FFPE, tejidos frescos congelados, microarrays de tejido y organoides. Además, ofrece análisis multiómico al integrar ARN y proteínas, con alta resolución subcelular, capacidad tridimensional y un rendimiento ajustable de entre 2 y 20 portaobjetos por semana.
En cuanto a las aplicaciones, mostró ejemplos en distintos tipos de muestras, como tejido FFPE de piel, TMA de pulmón, tejido fresco congelado de cerebro de ratón y organoides de cerebro humano. Seguidamente, precisó que “la plataforma dispone de ensayos pre-validados y personalizados, tanto para proteínas como para ARN, que abarcan áreas como la inmunooncología y la neurociencia, e incluyen paneles que van desde 100 hasta aproximadamente 19.000 dianas, así como opciones de ampliación mediante módulos adicionales de ARN o proteínas”.
Respecto al flujo de trabajo del CosMx™ SMI, explicó que se basa en una química de hibridación in situ de molécula única con imágenes cíclicas. “El proceso comienza con tejido FFPE montado en portaobjetos estándar, seguido de pasos de permeabilización, fijación e hibridación de sondas y anticuerpos”, enfatizó. Posteriormente, subrayó que “la muestra se ensambla en una celda de flujo y se somete a ciclos repetidos de hibridación de reporteros, adquisición de imágenes y eliminación de señales mediante luz UV, permitiendo el análisis secuencial de múltiples conjuntos de reporteros”.
Cardona también abordó el análisis in situ de célula única real, haciendo hincapié en la segmentación celular basada en imágenes, un proceso que, según el experto, “combina la adquisición de imágenes multicanal en Z-stack con algoritmos de aprendizaje automático para definir de forma precisa los límites celulares”. Como ejemplo, mostró los resultados obtenidos en muestras FFPE de carcinoma de células renales, donde se pudieron ver modelos específicos para citoplasma, núcleo y célula completa.
A nivel computacional, introdujo la plataforma AtoMx™ Spatial Informatics, “como un ecosistema integral para la informática espacial de célula única”. Esta plataforma permite análisis interactivos y multi-muestra, utiliza formatos de datos abiertos compatibles con R y Python, e incorpora herramientas de segmentación celular ajustables mediante aprendizaje automático, así como nuevos algoritmos diseñados específicamente para datos espaciales. En este apartado también se destacó la integración tecnológica con NVIDIA para tareas de procesamiento.
La tecnología STAMP aplicada a células en suspensión se presentó como una herramienta especialmente relevante para el análisis de biopsia líquida. Su flujo de trabajo incluye la fijación y preparación de las muestras, el estampado de células en diseños específicos de portaobjetos, y un posterior análisis de ARN y/o proteínas a nivel unicelular. Entre los resultados mostrados por Cardona se incluyeron análisis de morfodinámica, agrupamiento celular, perfiles de expresión génica y mapas de expresión diferencial.
Uno de los aspectos más destacados fue la capacidad de STAMP para detectar poblaciones celulares raras. Tanto es así que Cardona describió que “en un experimento con células MCF-7 diluidas en PBMC, la tecnología demostró sensibilidad para identificar poblaciones en concentraciones de hasta 0,00025%, utilizando diluciones extremas y analizando más de un millón de células en un único portaobjetos”.
Finalmente, concluyó destacando los puntos clave del CosMx™ SMI, destacando “su alta sensibilidad sin daño tisular, la segmentación celular precisa mediante algoritmos avanzados de inteligencia artificial, la disponibilidad de ensayos adaptables y personalizables que alcanzan el análisis combinado de transcriptoma completo y hasta 72 proteínas en una sola célula, y su capacidad para detectar tipos celulares raros como las células tumorales circulantes”. Además, subrayó la posibilidad de explorar la información molecular tanto a escala de célula única como a nivel subcelular, reforzando el valor de estas tecnologías para la investigación oncológica y biomédica.
Diferentes tecnologías para analizar el ctDNA
Por su parte, Daniel Azuara, del Catalan Institute of Oncology del Hospital Universitari de Bellvitge (L’Hospitalet de Llobregat), puso de relieve el papel central de la detección ultrasensible de mutaciones en ADN tumoral circulante (ctDNA) para la optimización del tratamiento en pacientes con cáncer de mama metastásico. La evidencia presentada por el experto refuerza la relevancia clínica de las mutaciones accionables y su impacto en la resistencia a la terapia endocrina, tanto primaria como adquirida”
“La resistencia intrínseca al tratamiento endocrino se ha relacionado con la presencia de mutaciones en los genes PIK3CA y ERBB2, mientras que la resistencia adquirida se asocia principalmente con mutaciones en ESR1”, sostuvo. Seguidamente, expresó que “estas alteraciones moleculares han permitido el desarrollo y la implementación de tratamientos dirigidos frente a dianas terapéuticas específicas, que han demostrado beneficio clínico frente a las terapias convencionales de segunda o tercera línea”.
Entre los tratamientos dirigidos destacados por Azuara se incluyen los inhibidores de PI3K, como alpelisib e inavolisib; los inhibidores de AKT, como capivasertib; los inhibidores de tirosina quinasa (TKI), entre ellos neratinib y tucatinib; y los degradadores selectivos del receptor de estrógeno (SERD) orales, como elacestrant, camizestrant, giredestrant e imlunestrant. En particular, explicó que “elacestrant mostró una mejora clínicamente significativa en la mediana de la supervivencia libre de progresión en pacientes con mutaciones en ESR1, independientemente de la frecuencia alélica mutante (VAF)”.
La intervención de Azuara incluyó una revisión comparativa de las diferentes tecnologías disponibles para el análisis del ctDNA, desde la extracción de la muestra de sangre hasta su cuantificación. “El cfDNA obtenido está compuesto por ctDNA, ADN de células normales y ADN derivado de hematopoyesis clonal, lo que condiciona la sensibilidad de detección a niveles bajos”, dijo, En este contexto, destacó que “la secuenciación Sanger detecta fracciones cercanas al 10%, mientras que PCR en tiempo real y NGS estándar alcanzan alrededor del 1%. Tecnologías más sensibles, como la PCR digital, permiten detectar fracciones del 0,1%, y el NGS optimizado alcanza niveles inferiores al 0,01%, con capacidad para identificar moléculas únicas, aunque con mayor complejidad y coste”, matizó.
El estudio que llevaron a cabo tuvo como objetivo optimizar la estrategia terapéutica en pacientes con cáncer de mama metastásico mediante un cribado molecular basado en una técnica ultrasensible de detección de mutaciones en ctDNA plasmático. La cohorte incluyó a 96 pacientes con enfermedad en progresión, en quienes se realizó una biopsia líquida antes de iniciar el tratamiento sistémico. Por su parte, para la recogida de muestras se emplearon dos tubos Streck de sangre por paciente, obteniéndose ocho alícuotas de plasma por individuo.
A continuación, Azuara detalló que la extracción de ctDNA se llevó a cabo de forma equitativa utilizando dos metodologías: un kit manual en 48 pacientes y el sistema automatizado QIAsymphony en los otros 48. “El análisis molecular se realizó mediante el Plasma-SeqSensei™ kit IVD para cáncer de mama, desarrollado por Sysmex, lo que permitió una estandarización del proceso analítico”, admitió.
Para ilustrar los resultados obtenidos, presentó un informe de muestra generado por el software de Sysmex correspondiente al Sample M0001. El análisis, realizado en 2024, utilizó 6.252 genomas equivalentes de ADN y cumplió todos los criterios de validez de la carrera y la muestra. En esta muestra detectaron mutaciones en ESR1, PIK3CA y TP53, con fracciones alélicas mutantes inferiores al 2% y, en algunos casos, por debajo del 0,2%, lo que ilustra la alta sensibilidad del método.
Tras el proceso de selección, Azuara confirmó que la población final analizada quedó constituida por 88 pacientes. “En 33 de ellos no se detectaron mutaciones, mientras que en 55 se identificaron alteraciones genómicas. De este último grupo, 53 pacientes, lo que representa aproximadamente el 60% de la cohorte analizada, presentaron al menos una mutación accionable, subrayando la relevancia clínica de la biopsia líquida en este contexto”, matizó.
En cuanto a la prevalencia de mutaciones accionables, indicó que “PIK3CA fue la más frecuente, presente en el 47% de los pacientes, seguida de ESR1 con un 37%, ERBB2 con un 10% y AKT1 con un 6%”. Asimismo, señaló que “un hallazgo relevante fue que en el 57% de los pacientes con al menos una mutación accionable, la VAF fue inferior al 1%, lo que refuerza la necesidad de técnicas de alta sensibilidad”.
El análisis detallado de PIK3CA mostró que las variantes H1047R y E545K fueron las más prevalentes, ambas con un 32%, seguidas de E542K, H1047L, N345K y E726K. En el caso de ESR1, la variante más frecuente fue D538G, presente en el 45% de los casos, seguida de Y537S y E380Q. En este gen, el 86% de las pacientes presentaron mutaciones con una VAF inferior al 1%.
En cuanto a accionabilidad, Azuara vinculó estos hallazgos genómicos con opciones terapéuticas concretas y ensayos clínicos específicos. “Se identificaron 29 casos con mutaciones en PIK3CA asociados a inhibidores de PI3K, 16 casos con mutaciones en ESR1 vinculados a SERDs orales, seis casos con alteraciones en ERBB2 asociados a terapias combinadas con trastuzumab y TKI, y dos casos con mutaciones en AKT relacionados con capivasertib”, pronunció.
Como conclusiones generales, expresó que “el estudio demostró que la detección ultrasensible de mutaciones en ctDNA es clínicamente informativa en el cáncer de mama metastásico, con una tasa de accionabilidad del 60%”. Además, destacó que “la positividad del ctDNA se asoció a una supervivencia libre de progresión más corta, y la variabilidad en los momentos de muestreo subrayó la necesidad de una implementación estandarizada de la biopsia líquida en la práctica clínica habitual”.
Aprovechar el ARN libre circulante
Por último, la ponencia de João Curado, Flomics Biotech (Barcelona), se centró en la importancia de aprovechar el ARN libre circulante (cfRNA) para monitorizar la dinámica del cáncer. En este sentido, Flomics Biotech ha desarrollado una plataforma basada en cfRNA con el objetivo de mejorar la detección, caracterización y seguimiento de la enfermedad oncológica. Curado expuso que su primer producto consiste “en una prueba diagnóstica de biopsia líquida orientada a la detección precoz de cinco tipos de cáncer, mientras que actualmente se exploran otras aplicaciones clínicas adicionales”.
Acto seguido, reveló que la propuesta de Flomics parte de una crítica a las biopsias líquidas basadas en ADN, resumida en la premisa de que “estas técnicas dependen de la muerte celular para generar señal biológica”. Según expuso Curado, el ADN libre de células (cfDNA) es una señal tardía, ya que se libera principalmente durante procesos de apoptosis o necrosis. Este hecho se asocia a una detección tardía de la enfermedad, destacándose que aproximadamente el 70% de los cánceres se diagnostican cuando ya existen síntomas clínicos y que el 60% de los cánceres en estadio I no son detectados mediante pruebas basadas en ADN. “Este enfoque reactivo se vincula a un impacto negativo en salud y a costes sanitarios elevados y evitables”, subrayó.
Frente a estas limitaciones, manifestó que Flomics Biotech defiende el uso del ARN como biomarcador en biopsia líquida. En la comparativa presentada entre ADN y ARN, “el ADN lo describió como una molécula estática que refleja el riesgo de desregulación, mientras que el ARN se caracteriza como dinámico, al representar las vías biológicas activas de la célula”. En términos de abundancia, recordó que “el ADN está presente en dos copias por célula, mientras que ciertos transcritos de ARN pueden encontrarse en miles de copias”. Además, explicó que “el ADN se libera tras la muerte celular, mientras que el ARN puede ser secretado activamente”. “En el contexto del cáncer, el ctDNA suele encontrarse en cantidades bajas en estadios tempranos, mientras que el cfRNA está presente en niveles elevados en todas las etapas de la enfermedad”, sostuvo.
Según Curado, las ventajas del ARN se resumen en tres pilares. En primer lugar, señaló que “la mayor cantidad de ARN amplifica la señal biológica disponible para el análisis. En segundo lugar, la señal del ARN es más rica, ya que refleja procesos dinámicos y funcionales más allá de mutaciones estáticas”. Por último, dijo que “el ARN proporciona una visión más amplia del estado del organismo, al ser liberado tanto por células tumorales como por células no tumorales, incluyendo las del sistema inmune”.
Curado expuso que “la secuenciación de ARN (RNA-seq) permite capturar información fundamental sobre la biología tumoral e identificar biomarcadores potenciales. Entre sus aplicaciones se incluyen la estratificación tumoral, como el subtipado molecular consensuado en cáncer colorrectal; la caracterización de la biología funcional del tumor, ejemplificada en el estudio del microambiente inmunológico en carcinoma renal de células claras; y la identificación de biomarcadores para pronóstico, respuesta terapéutica y seguimiento, como firmas de expresión génica asociadas a la vía TGF-beta en pacientes no respondedores a inmunoterapia”.
Además, declaró que el “RNA-seq permite explorar múltiples capas de desregulación molecular que van más allá de la expresión génica”. Entre ellas se incluye la desregulación del splicing, ejemplificada por el salto del exón 14 de MET en cáncer de pulmón; las fusiones génicas, como EML4-ALK, resultado de inversiones cromosómicas; y el análisis de ARN no codificantes, como miRNAs, lncRNAs y ARN circulares. Un ejemplo destacado es circHIPK3, cuya formación y funciones ilustran la complejidad reguladora que puede capturarse mediante RNA-seq.
En cuanto al origen del cfRNA, Curado indicó que este “puede liberarse tanto por células tumorales como no tumorales a través de muerte celular, secreción activa mediante exosomas o mediante complejos proteína-ARN”. “Entre los tipos de cfRNA detectables se incluyen ARNs codificantes como el mRNA y una amplia variedad de ARNs no codificantes, como lncRNA, circRNA, miRNA, rRNA, tRNA, snRNA y snoRNA. No obstante, también se reconocen desafíos técnicos, como el hecho de que el 97% del cfRNA corresponde a ARN ribosómico, su alta fragmentación e inestabilidad, y la complejidad de su interpretación biológica”, matizó.
“La plataforma tecnológica de Flomics transforma una muestra de sangre en un perfil de salud multicapa. El flujo de trabajo comienza con la extracción y secuenciación automatizada del cfRNA y continúa con el análisis mediante la plataforma ARDeNA™, que procesa más de 1,5 millones de puntos de datos únicos por muestra. Este análisis integra siete capas de información, incluyendo abundancia génica, estado del splicing, fusiones génicas, uso de promotores alternativos, deconvolución del tejido de origen, ARN microbiano y detección de mutaciones, culminando en un informe clínico accionable”, recalcó Curado.
Además, destacó que “su plataforma cfRNA-seq ofrece un equilibrio entre una pureza de ARN de primer nivel y una captura exhaustiva de biomarcadores potenciales”. Asimismo, subrayó “su capacidad para identificar no solo la señal tumoral, sino también el tejido de origen del cáncer mediante modelos predictivos diseñados para clasificar el tipo tumoral más probable”.
Entre las aplicaciones clínicas exploradas, Curado presentó un estudio orientado a predecir la respuesta a inmunoterapia en melanoma. En este trabajo, explicó que “la plataforma ARDeNA se aplicó a muestras de plasma previas al tratamiento de 29 pacientes con melanoma cutáneo en estadio IV”. Tras el tratamiento, abundó que “los pacientes se clasificaron como respondedores o progresores, y se compararon sus perfiles de cfRNA para identificar biomarcadores asociados a la respuesta terapéutica”.
Como conclusiones y próximos pasos, afirmó que “Flomics Biotech ha desarrollado una plataforma de cfRNA-seq de nivel mundial con potencial para impulsar el uso del ARN libre de células en la práctica clínica”. A ello se sumó que” la compañía continúa desarrollando un test altamente prometedor para la detección del cáncer y explora su aplicación en otros escenarios clínicos, como la respuesta al tratamiento, la enfermedad mínima residual y la monitorización”. Finalmente, manifestó el interés de Flomics por “establecer colaboraciones, acceder a muestras y sumar experiencia clínica con el objetivo de consolidar el ARN como un complemento sólido a cualquier tipo de biopsia líquida”.
